Exocitose

 

A Exocitose é a inversa da endocitose.

Exocitose é o transporte de material para fora de uma célula por meio de um saco ou de vesículas que primeiro engole o material e, em seguida, é submetida a extrusão através de uma abertura na membrana celular (distinguida da endocitose ).

Exocitose é a libertação de substâncias celulares (como produtos de secreção) contido nas vesículas de células por meio da fusão da membrana vesicular com a membrana plasmática e libertação subsequente do conteúdo para o exterior da célula

Processo

Exocitose é um processo de secreção celular ou excreção em que as substâncias contidas nas vesículas são descarregadas a partir da célula através da fusão da membrana vesicular com a membrana celular externa.

Endocitose e exocitose

O movimento de macromoléculas tais como proteínas ou polissacáridos para dentro ou para fora da célula é chamado de transporte a granel.

Existem dois tipos de transporte a granel: exocitose e endocitose, e ambos exigem o gasto de energia (ATP).

Na exocitose, os materiais são exportados para fora da célula via vesículas secretoras. Neste processo, os pacotes do complexo de Golgi macromoléculas em vesículas de transporte e que viajam para fundir com a membrana plasmática. Esta fusão faz com que a vesícula para derramar o seu conteúdo para fora da célula.

A exocitose é importante na expulsão dos materiais residuais para fora da célula e na secreção de produtos celulares, tais como hormonas ou enzimas digestivas.

Endocitose, por outro lado, é o processo pelo qual os materiais de mover para dentro da célula.

Existem três tipos de endocitose: fagocitose, pinocitose, e endocitose mediada por receptores. Em fagocitose ou “comer celular,” membrana plasmática da célula envolve uma macromolécula ou mesmo de toda uma célula a partir do meio extracelular e de gemas de folga para formar um vacúolo de alimentos ou fagossoma.

O fagossoma recém-formado, em seguida, se funde com um lisossomo cujo enzimas hidrolíticas digerir o “alimento” para dentro.

O que é

Exocitose é o processo pelo qual uma célula eucariótica viva liberta substâncias para o fluido extracelular, seja o fluido que envolve as células dum tecido, nos organismos multicelulares, seja para o ambiente aquático, por modificação da membrana celular, ou seja, sem ser por difusão. É o oposto de endocitose.

As substâncias a serem libertadas pela célula podem ser produtos de excreção, secreções, tais como toxinas ou hormonas, ou neurotransmissores (nas sinapses dos nervos).

Neste processo, uma vesícula com as substâncias a serem libertadas funde-se com a membrana celular e, a seguir, realizam-se três ações:

A superfície total da membrana celular aumenta, uma vez que agrega a si a membrana da vesícula. Esta é uma das formas de crescimento das células;
As substâncias que se encontravam dentro da vesícula são libertadas para o exterior; e
As proteínas da membrana vesicular encontram-se agora do lado de fora da membrana celular, proporcionando um mecanismo de regulação dos receptores e transportadores transmembrana.

Exocitose – Vesículas de Transporte

Exocitose são vesículas de transporte que se destinam a membrana plasmática normalemente deixam a rede de Golgi trans em um fluxo constante. A proteínas de membrana e os lipídeos, nessa vesículas, fornecem novos componentes para a membrana plasmática, enquanto as proteínas solúveis dentro das vesículas são secretadas para o espaço extracelular.

A fusão das vesículas com a membrana plasmática é denominada exocitose. Desta forma, as células pode produzir e secretar por exemplo muitas das proteoglicanas e as glicoproteínas da matriz extracelular.

Todas as células necessitam desta via receptora constitutiva. Entretanto, células secretoras especializadas possuem uma segunda via secretora na qual proteínas solúveis e outras substâncias são armazenadas inicialmente em vesículas secretoras, para serem liberadas mais tarde. Esta é a via secretora regulada, que é encontrada principalmente em células que são especializadas na secreção de produtos com os hormônios, os neurotransmissores e enzimas digestivas, de uma forma rápida, de acordo com a sua demanda.

Nas vias reguladas, as moléculas são armazenadas em vesículas que não se fundem com membrana plasmática para liberar seu conteúdo até que um sinal extracelular seja recebido. Uma condensação seletiva das proteínas direcionadas para as vesículas secretoras acompanha seu empacotamento, nestas vesículas na rede de Golgi trans.

As vesículas sinápticas são confinadas às células nervosas e algumas células endócrinas; elas são formadas a partir dos endossomos e são responsáveis pela secreção regulada de moléculas pequenas de neurotransmissores. Enquanto as vias reguladas operam apenas em células secretoras especializadas, uma via constitutiva opera em todas as células, mediadas pelo contínuo transporte por vesículas a partir da rede de Golgi trans, para a membrana plasmática.

As proteínas produzidas no RE são automaticamente encaminhadas a rede de Golgi trans e depois para a membrana plasmática pela via constitutiva ou de default, a menos que sejam desviadas para outras vias ou sejam retidas por sinais de seleção específicos. Entretanto, em células polarizadas, as vias de transporte, a partir da rede de Golgi trans para a membrana plasmática, devem operar seletivamente para garantir que conjuntos diferentes de proteínas de membrana, proteínas secretadas e lipídeos sejam levados aos domínios apropriados da membrana plasmática.

Exocitose – Formação

O tráfego vesicular em células eucarióticas é essencial para processos celulares diversos, incluindo a manutenção de compartimentos celulares distintos, secreção de proteínas e hormônios, fertilização do óvulo e liberação de neurotransmissores.

O ciclo de vida de uma vesícula geralmente consiste de 3 estágios (figura 1): endocitose ou formação da vesícula a partir de membranas celulares específicas; exocitose ou fusão da vesícula com sua membrana alvo; e reciclagem dos componentes da maquinaria protéica após a exocitose. Esta revisão irá focalizar os recentes estudos estruturais das proteínas chaves responsáveis pela exocitose e a reciclagem.

Figura 1: ciclo de vida de uma vesícula sináptica.

A exocitose vesicular é controlada por uma maquinaria protéica que é conservada em organismos percorrendo de leveduras a humanos. Proteínas SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fator [NSF]- attachment protein recceptor) são componentes essenciais desta maquinaria.

Em exocitose de vesículas sinápticas, três proteínas SNARE estão envolvidas: As proteínas associadas a membrana plasmática sintaxina e SNAP-25 ( proteína de 25 KDa associada a sinaptossoma) e a proteína vesicular sinaptobrevina também referida como VAMP (vesicle-associated membrane protein).

Outras proteínas conservadas incluem o NSF ATPase e sua adaptadora SNAP, a classe Rab de pequenas proteínas G e seus efetores, a família sinaptotagmina e a família nSec1 ( homólogo neuronal da proteína Sec1 de levedura, também referida como Munc 18). Muitos outros fatores que interagem com SNAREs, como as complexinas, VAP33 ( proteína de membrana associada a vesícula/ proteína ligadora de sinaptobrevina) e sinaptofisina têm sido caracterizados.

Figura 2: Estágios e proteínas chaves envolvidas na fusão de membrana de vesícula. As proteínas estão coloridas de acordo com o código: sinaptobrevina (azul escuro), sinaptofisina (azul claro), sintaxina (vermelho), nSec1 (marrom), SNAP-25 (verde escuro), sinaptotagmina (amarelo), Rab3A (círculo vermelho escuro), rabfilina-3A (verde palha), canal de cálcio (magenta), NSF (rosa) e a –SNAP(azul celeste). Pi, fosfato inorgânico.

A figura dois resume alguns dos estágios chaves envolvidos na fusão de vesículas sinápticas. Inicialmente, sintaxina está ligada a nSec1 e sinaptobrevina está provavelmente ligada a um fator tal qual sinaptofisina. Ambas, sintaxina e sinaptobrevina são proteínas com um domínio transmembrana. No estágio de ancoragem, o complexo sintaxina-nSec1 é dissociado talvez assistido por uma proteína efetora Rab. Sinaptobrevina então se liga a sintaxina e SNAP-25. No estágio de preparação (priming), o sistema se torna competente a sofrer fusão desde que haja um aumento na concentração de cálcio, possivelmente envolvendo uma proteína ligadora de cálcio tal como sinaptotagmina. No estágio de reciclagem, a -SNAP (a soluble NSF-attachment protein) e NSF se ligam ao complexo SNARE e o complexo é então dissociado após hidrólise de ATP.

Antes da ancoragem, as vesículas têm que ser direcionadas para a localização correta no tempo apropriado. Este direcionamento não é nem de longe tão bem entendido como os estágios finais de fusão de vesícula. Entretanto, alguns dos componentes moleculares para o processo de direcionamento estão começando a serem caracterizados. Entre eles estão os complexos sec6/8 em células de mamíferos e o complexo exocist em levedura. Estes são complexos macromoleculares grandes (>700KDa) que poderiam estar envolvidos nos processos de direcionamento antes dos SNAREs estarem envolvidos.

SNAREs

O complexo SNARE pode ser isolado a partir de extratos de células neuronais. Ele podem ser também montado a partir de proteínas recombinantemente expressas e purificada in vitro. As âncoras de membrana não são necessárias para a montagem do complexo SNARE, assim a maioria dos estudos biofísicos e estruturais têm sido realizados com os domínios solúveis dos SNAREs. O complexo SNARE exibe notável estabilidade térmica e química. A proteólise limitada do complexo SNARE sináptico tem revelado um complexo central com propriedades biofísicas similares ao complexo integral. Este complexo central é suficiente para promover fusão de vesícula in vitro.

O complexo central SNARE (cerne) consiste de um barril de quatro hélices paralelas enquanto o domínio aminoterminal da sintaxina consiste de um barril de três hélices anti-paralelas (figura 3 e 4). O cerne do barril de quatro hélices do complexo SNARE é composto de camadas formadas pela interação das cadeias laterais de cada uma das 4 a -hélices. Estas camadas são altamente conservadas através da família SNARE inteira. No centro do complexo central (cerne) uma conservada camada iônica tem sido encontrada e consiste de um resíduo de arginina e três de glutamina contribuídos de cada uma das 4 a -hélices.

Interessantemente, esta camada iônica está selada contra a água por camadas hidrofóbicas adjacentes. Esta configuração um tanto quanto energeticamente desfavorável presumivelmente tem algum papel funcional durante a associação ou dissociação do complexo SNARE.

Figura 3: Estrutura cristalizada conhecida dos componentes do complexo 20S- complexo SNARE, a –SNAP( ou seu homólogo Sec 17 em levedura) NSF-N, NSF-D2 e a localização especulativa em uma micrografia eletrônica de média rotacional do complexo 20S. O acondicionamento (enovelamento) do domínio NSF-D2 na grade P6 cristalográfica forma um hexâmero que se assemelha co as características de anéis em forma de cone da micrografia eletrônica. Como os domínios D1 e D2 possuem seqüências primárias similares, suas estruturas são também provavelmente similares. Isto sugere que os domínios D1 e D2 compreendem os dois anéis. A localização do domínio-N foi sugerida comparando o empacotamento trimérico dos três domínios NSF-N por unidade assimétrica de uma das formas cristalizadas com a micrografia eletrônica.

Mutações nesta e em outras camadas reduzem a estabilidade do complexo e causam defeitos no tráfego de membrana mesmo em SNAREs distantemente relacionadas.

Baseado na conservação do cerne do complexo SNARE, as SNAREs foram reclassificadas em Q-SNARE e R-SNARE e propõe-se que complexos SNARE competentes a sofrerem fusão (priming) geralmente consistem de barris de 4 alfa-hélices compostos na razão de 3 (Q-SNARE): 1(R-SNARE). Uma possível exceção à regra 3Q:1R é o sistema de fusão vacuolar homotípico no qual 5 SNARE distintas interagem. Entretanto, estes experimentos foram realizados com extratos de levedura e analisados por imunoprecipitação, portanto não está claro que todas as 5 SNAREs vacuolares interajam quantitativamente em um complexo pentamérico único.

Figura 4: Sumário das estruturas das proteínas envolvidas na exocitose em vesícula sináptica: complexo SNARE (sinaptobrevina-azul escuro; sintaxina-vermelho; SNAP-25-verde); complexo sintaxina-nSec1 (sintaxina-vermelho; nSec1-marrom); Rab3A-rabfilina-3A (Rab3A-círculo vermelho escuro; rabfilina-3A-verde palha).

As SNAREs têm, no mínimo, três estados conformacionais (figura 5): primeiro, a conformação “fechada” da sintaxina dissociada do complexo e a conformação flexível ou não estruturada de sinaptobrevina e SNAP-25 (figura 5a); segundo, o complexo binário da sintaxina e SNAP-25 (figura5b); e terceiro, o complexo ternário da sintaxina, SNAP-25 e o domínio citoplasmático da sinaptobrevina (figura 5c,d). A conformação fechada da sintaxina dissociada do complexo contém um barril de 4 hélices composto do domínio aminoterminal regulatório HAHBHC e aproximadamente metade do domínio do complexo central Hcore (figura 5a). A topologia desta conformação fechada foi deduzida por dados de ressonância magnética nuclear. Uma conformação similar da sintaxina foi recentemente observada na estrutura cristalizada da sintaxina no complexo sintaxina-nSec1 (figura 4), sugerindo que é a conformação fechada da sintaxina que se liga a nSec1.

Sintaxina muda para um estado “aberto” para se ligar a SNAP-25. Neste estado aberto, a ligação a outras SNAREs é mediado pelo domínio Hcore. Mudanças conformacionais no domínio Hcore, mediada pelo domínio N-terminal da sintaxina, representam um mecanismo regulador para a associação do complexo SNARE por afetar a cinética da formação do complexo ternário. A formação de complexos binários ou ternários está associada com uma indução aumentada da estrutura a -hélice nas regiões não estruturadas ou flexíveis. Como a metade N-terminal do domínio Hcore da sintaxina está sempre enovelada (figura 5), estes dados sugerem que a associação do complexo SNARE começa distal às superfícies da membrana e prossegue através delas. Este modelo “zipper” da fusão de vesícula tem sido proposto por experimentos utilizando transferência de energia ressonante fluorescente, microscopia eletrônica e polarização de spin eletrônico de complexos SNARE marcados.

Figura 5: Estados conformacionais e eventos envolvendo as proteínas SNAREs e seus possíveis papéis na fusão de vesícula. As SNAREs possuem no mínimo três estados conformacionais: (a) fechado; (b) binário; (c,d) ternário. Sinaptobrevina-azul; sintaxina-vermelho; SNAP-25-verde. Indeterminado, nenhuma informação disponível sobre a conformação ou conformações da proteína; Flexível, resíduos que estão provavelmente passando por significante mudança em solução e não são parte de um domínio rígido da proteína. C, região carboxi-terminal; N, região amino-terminal.

O PAPEL DAS SNAREs

Enquanto a função exata dos SNAREs é o tópico de alguns debates, existem várias evidências que eles desempenham um papel fundamental na fusão de membrana. Primeiro, a clivagem sítio específica das SNAREs por neurotoxinas clostridiais inibem a neurotransmissão.

Segundo, os SNAREs representam a maquinaria de fusão mínima: SNAREs reconstituídos em lipossomos artificiais podem induzir fusão in vitro.

Experimentos em um sistema de células PC12 permeabilizadas também confirmaram a importância dos SNAREs para a fusão in vivo. Terceiro, os domínios solúveis dos SNAREs espontaneamente reúnem-se em um barril de 4 hélices extremamente estável in vitro. A composição a -helical e a alta estabilidade térmica e química do complexo é similar para as proteínas que estão envolvidas na fusão viral, possivelmente indicando um mecanismo ancestral comum para ambos os sistemas de fusão. Quarto, a formação do complexo provavelmente prossegue de uma maneira direcional, iniciando no na extremidade do complexo distal à membrana e prosseguindo para a extremidade proximal à membrana.(figura 5). Este processo de associação direcional pode trazer proximidade às membranas, assim superando a barreira de energia livre para a stalk formation (figura 6).

Figura 6: Estágios da fusão de membrana baseados em estudos biofísicos de fusão de endossomas e um modelo hipotético de como os complexos SNAREs unem as membranas. A formação do estado stalk requer energia livre. As barreiras de energia livre existem entre os estados stalk, o estado de hemifusão e o estado fundido do sistema. A formação do complexo SNARE poderia reduzir o nível de energia livre do estado stalk e poderia reduzir ou aumentar os níveis das barreiras de energia livre em combinação fatores acessórios tais como sinaptotagmina em um modelo dependente de cálcio. A composição lipídica específica das vesículas sinápticas e a membrana plasmática poderia também desempenhar um papel na modulação destas barreiras de energia livre. G, energia livre requerida para justaposicionar as membranas; G‡, barreiras da energia livre que devem ser superadas para completar a fusão da vesícula com a membrana.

O modelo hipotético apresentado na figura 6 assume a existência de um estado parcialmente associado dos SNAREs ancorados entre duas membranas. Embora este estado não seja observado diretamente, há uma evidência indireta para um estado intermediário. Primeiro, os sítios de clivagem de todas as proteases neurotóxicas clostridiais estão localizadas na metade C-terminal (membrana proximal) do complexo central (cerne). Como as SNAREs são protegidas contra proteólise no complexo inteiramente associado, isso sugere que os SNAREs devem existir em estados parcialmente associados ou estados “frouxos” por períodos de tempos significativos.

Experimentos recentes apoiam esta hipótese: O C-terminal da sinaptobrevina é sensível a toxinas no estado ancorado, mas o N-terminal não é sensível.

Estudos cinéticos de exocitose em células cromoafins revelaram um estado fusão-competente que é sensível ao ataque de neurotoxinas clostridiais. A inibição da montagem do complexo SNARE por ligação de anticorpos afeta diferencialmente os componentes cinéticos da exocitose, sugerindo a existência de estados do complexo SNARE frouxo e compacto.

Análises de fusão de lipossomas artificiais induzida por polietileno glicol (PEG) têm sugerido a existência de 2 estágios intermediários da fusão de vesícula: um estado stalk e um estado de hemifusão (Figura 6). Assumindo que estados similares existam durante a fusão de vesículas celulares com as membranas alvo, pode-se especular que a formação do complexo SNARE poderia diminuir a barreira de energia livre a fim de alcançar o estado intermediário stalk. Adicionalmente, a formação do complexo SNARE poderia diminuir as barreiras do estado de transição de energia livre entre os estado stalk, o estado de hemifusão e o estado fundido do complexo SNARE. Entretanto é provável que outros fatores (tais como proteínas ou composição lipídica das vesículas sinápticas) estejam envolvidos na regulação destas barreiras de energia livre, especialmente em vista do fato de que a fusão de vesícula neuronal é estreitamente regulada por cálcio e prossegue em uma escala de tempo mais rápida (milissegundos) que pode ser acompanhada por fusão induzida por SNAREs in vitro (minutos).

Estudos in vitro da fusão vacuolar homotípia durante a divisão celular de levedura mostraram que os complexos SNARE podem ser dissociados antes da fusão. Estas observações não necessariamente excluem o papel dos SNAREs para a fusão de membranas. É possível que os complexos SNAREs possam ser dissociados, sem que haja a “desancoragem” das membranas. Caso o sistema já esteja comprometido para a fusão em um estágio irreversível de hemifusão.

As interações SNARE são promíscuas

A conservação da seqüência primária do core estrutural do complexo SNARE lança dúvidas sobre o papel de direcionamento dos SNAREs para o tráfego de vesículas, como foi originalmente proposto pela hipótese SNARE. De fato, muitas das propriedade biofísicas e bioquímicas têm sido obtidas in vitro para complexos consistindo de combinação artificiais de SNAREs que são localizados para diferentes compartimentos celulares in vivo. Além disso, alguns SNAREs podem funcionar em diversos passos de transporte diferentes in vivo. Assim, os SNAREs não podem ser os únicos determinantes para a especificidade de direcionamento das vesículas. Ao invés disso, as localizações observadas de SNARE podem ser importantes para as interações com outros fatores tais como nSec1 que interage com resíduos não conservados de SNARE.

Interações de sintaxina com nSec1

O estado parcialmente estruturado “fechado” da sintaxina interage com nSec1 (fig.4). A conformação da sintaxina encontrada na estrutura cristalográfica deste complexo é dramaticamente diferente da conformação da sintaxina encontrada no complexo SNARE ternário. Os resíduos carboxi-terminal da sintaxina que não são estruturados ou são flexíveis em solução adotam uma sequência de pequenos fragmentos a -hélice conectados por curtas loops quando está ligada a nSec1 formando um complexo. No complexo SNARE ternário esses resíduos formam uma a -hélice contínua.

As regiões flexíveis da sintaxina antes de formar o complexo SNARE poderiam ter estrutura local semelhante à estrutura da sintaxina no complexo nSec1-sintaxina (fig.4). É provável que nSec1 atue estabilizando uma das conformações da sintaxina antes de formar o complexo SNARE. A transição conformacional da sintaxina é um exemplo surpreendente do papel da flexibilidade conformacional na função biológica.

Experimentos em leveduras sugerem uma interação entre Sec1 e o complexo SNARE associado a membrana plasmática. Isto é um contraste com os achados em neurônios, em que interações entre sintaxina e nSec1 e entre sintaxina, SNAP-25 e sinaptotabrevina, são mutuamente exclusivas. Se as conclusões tiradas dos experimentos em leveduras e neurônios são corretas poder-se-ia especular que o homólogo de nSec1 em leveduras tem uma estrutura diferente, que duas conformações distintas existem para a família de proteínas Sec1, ou que uma interação transiente existe entre nSec1 e o complexo SNARE parcialmente associado.

SINAPTOTAGMINA

É uma proteína associada a membrana que interage com SNAREs, fosfolipideos de membrana, canais de Ca2+ e proteínas envolvidas na endocitose. Na porção citosólica dessa proteína um ligante (linker) de sete aminoácidos flexíveis une dois domínios homólogos C2, C2A e C2B (fig.4). O domínio C2A se liga a fosfolípideos aniônicos e a outras proteínas acessórias, tal como a sintaxina, de maneira dependente de Ca2+. Nenhuma mudança conformacional é observada após a ligação do Ca2+, exceto para mudanças rotaméricas de resíduos de ácido aspártico coordenados por Ca2+. O domínio C2B promove a ligação de outros domínios C2B, bem como a ligação de proteínas acessórias independentemente de Ca2+. Interessantemente, proteínas neuronais como a rabfilina e Doc2 também possuem múltiplos domínios C2 similares aos da sinptotagmina. A estrutura do domínio C2B da rabfilina é muito similar para o domínio C2B de sinaptotagmina III.

Sinaptotagmina e o complexo SNARE interagem independentemente de Ca2+, embora a interação seja acentuada pela adição de Ca2+. Os domínios de ligação ao Ca2+ provavelmente interagem com a membrana plasmática, enquanto as regiões poli-básicas poderiam interagir com o cerne do complexo SNARE.

Rab 3

Membros da família Rab de pequenas proteínas G regulam o tráfego vesicular de membranas em todas as células eucarióticas. Rab3A localiza-se predominantemente em vesículas sinápticas e desempenha um importante papel na regulação da liberação de neurotransmissores. Proteínas Rab eram suspeitas de serem determinantes da especificidade do direcionamento vesicular, pois isoformas distintas exibem localizações celulares únicas. Entretanto, estudos de proteínas Rab quiméricas sugerem que Rabs podem funcionar em dois passos de transporte distintos – o transporte vesicular do RE para Golgi e a fusão de vesículas secretórias pós-Golgi com a membrana plasmática – sugerindo que Rabs não podem ser os únicos determinantes do direcionamento. Como outras pequenas proteínas G, os membros da família Rab podem funcionar como chaves (switches) moleculares ou cronômetros, variando entre a forma inativa, ligada a GDP, e a forma ativa ligada a GTP e regulando suas proteínas efetoras e seus alvos downstream.

No citosol, proteínas Rab são mantidas no estado inativo, ligado a GDP pela Rab GDI (inibidor da dissociação de GDP), impedindo-as de se ligar inespecificamente às membranas. Quando Rab se liga a um compartimento doador específico ou vesícula, GDI é deslocado pelo fator de deslocamento de GDI (GDF). A troca de GDP por GTP é então catalisada pelas GEFs (fator de troca de guanina), ativando a proteína Rab e tornando-a resistente a remoção da membrana pela Rab GDI. GTP é hidrolizado pela atividade intrínseca da proteína Rab. A barreira do estado de transição da reação de hidrólise é diminuída pelas proteínas ativadoras de GTPase (GAPs). Uma vez que a fusão da vesícula tenha ocorrido, GDI pode liberar a forma ligada a GDP de Rab para o citoplasma e o ciclo começa novamente.

O knockout do gene Rab3A dificulta a regulação da liberação do neurotransmissor. A forma ligada ao GTP de Rab3A interage com, no mínimo, duas proteínas efetoras, rabfilina 3A e rim, que podem interagir com, , alvos downstream ainda desconhecidos. Rab3A ativada reversivelmente recruta rabfilina-3A para vesículas sinápticas. Rim tem similaridade de seqüência a rabfilina-3A, mas localiza-se na zona ativa da membrana pré-sináptica ao invés de nas vesículas sinápticas.

Um número relativamente grande de proteínas Rab e seus efetores estão presentes em células eucariótas. Uma base estrutural para o pareamento específico entre essas proteínas tem sido recentemente proposta baseada na estrutura de Rab3A-GTP-Mg2+ ligada ao domínio efetor de rabfilina-3A (fig.4). Rabfilina-3A contacta Rab3A primariamente em duas áreas distintas; poucas mudanças conformacionais são observadas após a formação do complexo. Baseado na estrutura cristalizada do complexo Rab3A-rabfilina-3A, foi proposto que pequenas proteínas G geralmente podem ter diversas áreas de superfície para o reconhecimento do efetor.

NSF

De acordo com um modelo atual, NSF e SNAP atuam juntas para dissociar os complexos SNARE ante e após a fusão. Proteínas SNARE podem formar ambos complexos cis (mesma membrana) e trans (membranas opostas) que são substratos para SNAPs e NSF. Como discutido acima, os complexos SNARE trans são importantes para a fusão de membranas. Fusão de membranas opostas resulta na formação de complexos SNARE cis que são dissociados para reciclagem e reativação pela ação conjunta de SNAP e NSF.

NSF é um hexâmero e pertence a família de proteínas AAA (ATPases associadas com as atividades celulares).

Cada NSF contém três domínios: um domínio amino-terminal requerido para ligação SNAP-SNARE e dois domínios ATPase, chamados D1 e D2. A ligação de ATP e hidrólise por D1 é necessária para a que ocorra a reação de dissociação de SNARE e a ligação de ATP, mas não a hidrólise, por D2 é necessária para a formação do hexâmero. SNAP e NSF ligam-se sequenciamente a complexos SNARE, formando os assim chamados particulas 20S, assim chamado devido ao comportamento de sedimentação do super complexo. (fig.3).

a -SNAP

Interações entre a -SNAP (Sec17), o homólogo de levedura de a -SNAP e SNAREs têm sido parcialmente mapeadas usando mutações e estudos de ligação in vitro. A região da SNAP que interage como complexo SNARE sobrepõe com suas regiões formadoras de complexo central. Isso, em conjunto com a estrutura do complexo central sináptico e a promiscuidade observada das interações SNAP-SNARE, sugerem que SNAPs reconhecem características gerais da superfície do barril de quatro hélices paralelas (forma ou distribuição de carga eletrostática). De fato, a curvatura dos sulcos do barril de quatro hélices do complexo SNARE é similar à curvatura da folha torcida de Sec17 (fig3). A microscopia eletrônica e estudos de mutagênese de complexos SNAP-SNARE sugerem que SNAP reveste o complexo SNARE ao longo da maior parte do seu comprimento.

CONCLUSÕES

Progressos significativos têm sido obtidos na elucidação das estruturas de proteínas envolvidas na exocitose vesicular.

Uma das mais intrigantes propriedades da maquinaria de fusão vesicular é a natureza altamente dinâmica de interações proteína-proteína: parceiros de ligação freqüentemente mudam e proteínas sofrem mudanças conformacionais dramáticas (fig.4). Estruturas cristalizadas podem apenas fornecer relances da maquinaria da proteína. Ainda permanece um desafio conectar esses fatos a fim de se obter um “filme” da maquinaria de fusão vesicular e dos próprios processos de fusão.

TRANSMISSÃO SINÁPTICA

A transmissão química entre células nervosas é o principal meio pelo qual as células nervosas comunicam-se. Os eventos pré e pós-sinápticos são altamente regulados.

A transmissão química requer os seguintes passos:

I. Síntese do neurotransmissor na terminação nervosa pré-sináptica;
II. Armazenamento dos neutransmissores em vesículas secretoras;
III. Liberação regulada do neurotransmissor (exocitose) na fenda sináptica entre o neurônios pré e o pós-sináptico;
IV. Receptores específicos para os neurotransmissores presentes na membrana pós-sináptica;
V. Meios que controlem a duração da ação do neurotransmissor no receptor pós-sináptico;

Há vários tipos de diferentes substâncias que atuam como neurotransmissores.

Elas têm sido divididos em três categorias:

1) Tipo I: Neurotransmissores que são aminoácidos como glutamato, GABA e glicina. Eles podem estar envolvidos na transmissão de até 90% de todas as sinápses no CNS;
2) Tipo II: Neurotransmissores clássicos como acetilcolina, catecolaminas e 5-hidroxitriptamina(5-HT). Estão presentes na maioria das áreas do cérebro e desempenham um papel modulador no CNS;
3) Tipo III: Neuropeptídeos que estão caracteristicamente presentes em concentrações muitos baixas. Neste grupo estão: somastostatina, vasopressina, substância-P, etc,

O processo de neurotransmissão envolve vários passos que são altamente regulados:

A) Na despolarização da membrana, abre canais de cálcio sensíveis a voltagem no terminal nervoso pré-sináptico. A alta concentração deste íon na zona ativa desencadeia a exocitose de vesículas sinápticas que estocam o neurotransmissor.

B) O neurotransmissor liberado na fenda sináptica interage com receptores na membrana pós-sináptica. Estes receptores podem estar acoplados a canais iônicos e assim, serem abertos ou podem atuar através de segundos mensageiros, tais como receptores acoplados a proteína G.

C) O neurotransmissor deve ser “desligado” do seu receptor. Eles podem ser inativados pela recaptação para dentro do terminal nervoso por proteínas de transporte acopadas a um gradiente de sódio, degradação ou captação e metabolismo pela células da glia.

D) A membrana da vesícula sinápticas que liberou o neurotransmissor é reciclada por endocitose via rede de clatrina.

O tráfego intracelular de membrana é um processo universal em todas as células eucarióticas, portanto, a todo momento todas as células realiazam diversa reações de tráfego de membrana simultaneamente.

Dois tipos de tráfego podem ser distinguidos no sistema nervoso:

I. Tráfego constitutivo ou de manutenção de membrana. É requisitado para a viabilidade geral e funcionamento de todas as células, incluindo neurônios, glia e células de suporte.
II. Tráfego especializado ou regulado de membrana que atua na sinalização intracelular e embora presente em várias células, é altamente desenvolvido em neurônios. Nestas células, este evento é responsável pelo tráfego de vesículas sinápticas que é a base da exocitose.

O tráfego intracelular de membrana é baseado nas mesmas operações fundamentais para todas as células:

I. As vesículas podem ser transportadas a partir de seu local de origem, podendo estar vazias ou cheias com seus respectivos neurotransmissores e/ou componentes internos.
II. Estas vesículas são deslocadas para seu local de destino, sua organela alvo, por difusão ou por moléculas motoras.
III. Em seu local de destino, as vesículas são ancoradas(Docking) na membrana,fundindo-se a ela( attach) . É importante ressaltar que há vários tipos diferentes de tráfego de membrana em todas as células, podendo este partir do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi ou a partir de endossomas para lisossomas.

A liberação do neurotransmissor na fenda sináptica é dependente do tráfego de vesículas sinápticas e, consequentemente tem alta influência na manutenção da transmissão sináptica. O tráfego de membrana é um processo importante para os componentes pré e pós-sinápticos. No terminal nervoso pré-sináptico, a liberação do neurotransmissor é mediada pela exocitose de pequenas vesículas que concentram em seu interior altas taxas de neurotransmissores. Portanto, o tráfego de membrana está diretamente envolvido na transmissão de sinal no lado pré-sináptico. Já na célula pós-sináptica, o tráfego de membrana é essencial para liberação dos receptores para seus lugares apropriados e para a regulação deste número.

CICLO DA VESÍCULA SINÁPTICA NA TERMINAÇÃO NERVOSA

Quando um potencial de ação chega em uma terminação nervosa , o Ca2+ flui para dentro da terminação via canais de Ca2+ sensíveis a voltagem e dispara a liberação de neurotransmissores por exocitose das vesículas sinápticas.

Sinapses centrais em vertebrados possuem 3 componentes:

1) O terminal nervoso pré-sináptico contém acúmulo de vesículas sinápticas;
2) No ponto de contato da sinapse , a membrana plasmatica pré sináptica é espessa dentro de uma zona ativa, na qual muitas vesículas sinápticas estão fundidas( attaches);
3) Do lado oposto da membrana pré-sináptica, na zona ativa, as células pós-sinápticas também formam um espessamento da membrana plasmática.

Analise morfológica das sinapses centrais do hipocampo ou cerebelo tem mostrado que a terminação nervosa tem um volume de 0,1 a 0,3 mm3 e contém aproximadamente 200 a 500 vesículas sinápticas por terminação.

Uma bomba de prótons na membrana da vesícula sináptica cria um gradiente eletroquímico, sendo que este gradiente fornecerá a energia necessária para a captação do neurotransmissor do citosol da célula para dentro da vesícula. Após estarem preenchidas com seus respectivos neurotransmissores, estas vesículas são conduzidas para a zona ativa da membrana pré-sináptica por um processo de translocação dependente ou não de moléculas motoras. Posteriormente, estas vesículas são ancoradas (docking) e fundidas (attaches) na zona ativa, sendo então, preparadas(priming) para uma liberação dependente de cálcio através de um processo que requer ATP, envolvendo uma reação de fusão parcial.

O Ca2+ então,desencadeia o processo completo de fusão (exocitose) em uma reação rápida que ocorre em menos que 100ms e envolve a ligação de múltiplos íons cálcio em seus sítios de ligação. Após terminada a exocitose, com liberação do neurotransmissor na fenda sináptica, estas vesículas são endocitadas rapidamente por depressões revestidas (coated pits) e recicladas para reiniciarem uma nova etapa. As vesículas sinápticas iniciam o ciclo novamente passando através de intermediários endossomais ou diretamente sem passar por este intermediário de tráfego.

O ciclo de vesícula sináptica tem um tempo aproximado de 60 segundos. Dentro deste tempo, a fusão desencadeada pelo cálcio ocorrre em menos que 1 milisegundo.A ancoragem(docking) e a preparação (priming) possuem um tempo estimado de 10 a 20 milisegundos e a endocitose ocorre em alguns segundos.

Portanto, os processos que requerem maior tempo no ciclo são a captação do neurotransmissor e a reciclagem destas vesículas. Importante também é ressaltar que a reciclagem das vesículas ocorre no terminal nervoso, gerando uma certa autonomia do ciclo das vesículas em relação ao núcleo. Este processo é fundamental, pois o terminal nervoso pode estar separado do núcleo por mais de 100 cm.

COMPOSIÇÃO DAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

Vesículas sinápticas são organelas abundantes, de tamanho uniforme e com um diâmetro de aproximadamente de 40 nm. Como pequenas organelas, as vesículas sinápticas podem acomodar apenas um número limitado de proteínas e fosfolipídeos. Cálculos indicam a presença de 10.000 moléculas de fosfolípides e um peso molecular protéico de aproximadamente 5.000.000 ~10.000.000 por vesícula. Dentro de uma média, estima-se que haja 200 proteínas em uma vesícula. Estas vesículas possuem o interior ácido em um pH~5.5, mantido por uma bomba de prótons. A única função sabiamente conhecida das vesículas sinápticas é a liberação de neurotransmissores. Contudo, a sua abundância e uniformidade em tamanho têm auxiliado nos estudos bioquímicos para caracterizá-las, tornando-as assim, uma das organelas melhores descritas na Biologia. Na tabela 1há uma descrição da maioria das proteínas de vesículas sinápticas

Funcionalmente, as proteínas de vesícula são separadas em dois grupos:

1) Proteínas de transporte que executam a captação de neurotransmissores e outros componentes para dentro das vesículas.
2) Proteínas de tráfego que atuam no tráfego intracelular de vesículas sinápticas

Na primeira classe, está incluída uma bomba de prótons que acidifica o interior das vesículas gerando um gradiente eletroquímico transmembrana. Esta bomba é um tipo vacuolar composta de, no mínimo, 12 subunidades e, provavelmente, cada vesícula possui apenas uma cópia desta proteína. Importante é ressaltar que o gradiente eletroquímico gerado por esta bomba fornecerá o combustível para a captação dos neurotransmissores pelos seus respectivos transportadores. Adicionalmente, estas vesículas contém proteínas requeridas para transportar íons Zn e Cl.

Interessantemente, as proteínas de tráfego intracelular de vesículas sinápticas são membros de uma família de genes que contém múltiplas isoformas. Tipicamente, estas famílias de genes incluem proteínas que são primariamente expressas em neurônios nas vesículas sinápticas e proteínas que são encontradas ubiquamente em muitos tecidos diferentes.

Exemplo: as 4 isoformas da sinaptofisina geradas por splicing alternativo dos transcritos de dois genes são coexpressas em todas as áreas do cérebro, com raras exceções, no entanto sinaptotagmina I e II são expressas quase sempre em diferentes neurônios. Rab3A e Rab3C entretanto são expressas de tal maneira que que rab3A é a isoforma dominante em quase todas as regiões, enquanto rab3C é seletivamente expressa em altos níveis em subgrupos de neurônios.

As funções específicas da maioria das proteínas de vesículas sinápticas ainda são incertas. Algumas podem ter homologia com proteínas transportadoras presentes em eucariotos e bactérias como SV2s que são proteínas de vesícula com função ainda incerta. Há também as proteínas CSP que possuem um domínio homólogo a DNA-J. Porém, a maioria das proteínas não tem similaridades com proteínas conhecidas.

CARACTERÍSTICAS DA EXOCITOSE NAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

O evento chave no ciclo da vesícula sináptica é a reação de fusão delas desencadeada por um fluxo de íons calcio que resulta na liberação do neurotransmissor. A exocitose é seguida por uma rápida endocitose que permite reutilizar as vesículas.

As sinapses necessitam transmitir sinais de maneira altamente localizada e rápida, sendo que estas duas exigências são: localização exclusiva da exocitose na zona ativa e a velocidade com a qual o cálcio desencadeia a exocitose.

A liberação do neurotransmissor envolve, no mínimo três passos:

1) Ancoragem( docking) e fusão (attach) das vesículas sinápticas na zona ativa da membrana pré-sinaptica;
2) Preparação para que as vesículas sinápticas competentes sejam sensíveis ao sinal de cálcio;
3) O pulso do cálcio dispara a reação de fusão das vesículas. Para que a ancoragem (docking) aconteça apenas na zona ativa, deve haver um sinal de reconhecimento entre esta e as vesículas sinápticas. Porém, esta função até o presente é incerta.

Toda vez que um potencial de ação alcança o terminal nervoso, canais de cálcio sensíveis à voltagem se abrem e o cálcio flui através do mesmo. Embora cada potencial de ação pareça conduzir a abertura dos canais de Ca+2 e um influxo do íon para dentro dos terminais nervosos, nem todo sinal conduz para exocitose das vesículas. Outra grande característica das sinapses é que embora muitas vesículas pareçam estar ancoradas ( docking) na zona ativa em um dado momento, prontas para fundirem com a membrana pré-sináptica, o Ca+2 freqüentemente dispara a exocitose de apenas uma. Isto sugere um grau não usual de regulação, o qual limita a resposta das vesículas ancoradas na zona ativa ao cálcio.

A alta velocidade com que o cálcio dispara a exocitose sugere que este íon atue apenas no processo de exocitose, ou seja, na liberação do neurotransmissor. Esta evidência indica que o cálcio atue apenas no estágio final da reação de fusão. Portanto, antes do íon atuar, as vesículas sinápticas sofrem uma reação de preparação (priming) durante a qual elas se tornam competentes para responder ao cálcio e iniciar o processo de fusão. Há estudos que indicam também que o processo de preparação possa ser regulado por por este íon. É possível também que a preparação envolva hemifusão e fusão de apenas uma das duas bicamadas lipídicas. Na sinapse, isto envolveria as bicamadas citoplasmáticas da vesícula sináptica e membranas plasmáticas sem participação das camadas exteriores, porém esta idéia ainda necessita de comprovação.

PROTEÍNAS COM FUNÇÕES NA EXOCITOSE DAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

1) Sinapsinas

Também chamadas de p38, podem atuar na ancoragem das vesículas sinápticas.Estudos em camundongos knockout para o gene da sinapsina sugerem que as vesículas sinápticas podem ser desestabilizadas na ausência dessa proteína ocorrendo um aumento da liberação durante a plasticidade sináptica que se torna defeituosa. In vitro as sinapsinas interagem com microtúbulos, microfilamentos, neurofilamentos e espectrina, porém a ação da sinapsina in vivo permanece obscura.

As toxinas do botulismo e tetano alcançam os terminais nervosos e inibem a exocitose das vesículas sinápticas. Essas toxinas atuam intracelularmente como proteases e uma simples molécula é capaz de envenenar todo o terminal nervoso, o que leva a neuropatia em humanos. Essas toxinas impedem a liberação das vesículas disparada pelo Ca2+, sugerindo que elas podem atuar durante a reação de preparação (priming) (Fig. 9-3). As toxinas do botulismo e tetânica são proteases muito específicas. Toxinas do botulismo B, D, F, G e H e a tetânica clivam uma única proteína, a VAMP (sinaptobrevina).

As toxinas do botulismo A e E clivam a SNAP-25 só a toxina do botulismo C1 cliva a SNAP-25 e sintaxina. A clivagem dessas três proteínas por essas toxinas sugere que elas atuam na reação de preparação (priming). As três proteínas (SNAP-25, sintaxina e VAMP) estão diretamente envolvidas na fusão da vesícula sináptica. Elas interagem umas com as outras para formar um complexo trimérico estável. Após a fusão o complexo se desfaz e cada componente protéico retorna à conformação ativa para a próxima reação de fusão. Quem realiza esta função é uma ATPase chamada fator sensível a N-etilmalimida (NSF) que atua como uma chaperone em conjunto com proteínas anexas chamadas de SNAPs (solluble-NSF attachment proteins)

2) Sinaptotagmina

É uma proteína intrínseca da membrana da vesícula sináptica em que se ligam íons cálcio e fosfolipídeos e atua como sensor de cálcio. Ela contém dois domínios citoplasmáticos de ligação ao Ca2+ (domínio da família C2). Estudos em camundongos knockout para a sinaptotagmina I mostram que a privação desta proteína impede severamente a exocitose da vesícula disparada por Ca2+, no entanto a exocitose disparada por solução hipertônica de sacarose é normal, sugerindo que a sinaptotagmina I é essencial para o processo de exocitose desencadeado pelo influxo de Ca2+.

O mecanismo de ação ainda é incerto, a ligação do cálcio a sinaptotagmina desencadeia a interação de seu primeiro domínio C2 com fosfolipídeos e com sintaxina, ambos envolvidos na reação de fusão das vesículas sinápticas (exocitose). A ligação do Ca2+ ao segundo domínio C2 causa associação da sinaptotagmina com ela mesma, dentro de uma grande estrutura, possibilitando formação de estruturas semelhantes a poros. Assim a sinaptotagmina é um excente candidato à mediação do processo de liberação disparada por Ca2+.

Todas as vesículas sinápticas possuem sinaptotagminas em sua membrana e muitas estão ancoradas(docked) na zona ativa a todo momento. Por que nem todas as vesículas ancoradas na zona ativa fundem-se com a membrana plasmática quando ocorre influxo de Ca2+ no terminal nervoso? A exocitose parece ser limitada a poucas vesículas por ação da rab3, uma proteína G de baixo peso molecular das vesículas sinápticas. Na ausência de rab3 e presença de Ca2+, muitas vesículas se fundem, sugerindo que rab3 regula o número de vesículas que são capazes de responder ao Ca2+. Duas pequenas proteínas interagem com rab3 somente quando esta se liga ao GTP, mas não quando ligada a GDP. Uma delas, a rabfilina é recrutada para a vesícula pela rab3 para torna-se uma proteína periférica da mesma. A outra, chamada RIM é uma proteína da mesmbrana plasmática que pode interagir com rab3 na vesícula somente quando esta está próxima da zona ativa.

CARACTERÍSTICAS E PROTEÍNAS DA ENDOCITOSE DAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

1) Clatrina

A endocitose da vesícula sináptica é provavelmente muito similar mecanisticamente à endocitose mediada por receptor em fibroblastos, porém esta endocitose possui características que são diferentes das dos fibroblastos. A endocitose das vesículas sinápticas é mais rápida que nos fibroblastos, sugerindo que ela é mediada. A composição das proteínas das vesículas sinápticas é diferente das da zonas ativa e de outras partes da membrana plasmática pré-sináptica. Após a exocitose, essas proteínas não se misturam. Isto porque a endocitose é muito rápida e ocorre imediatamente após a exocitose. A vantagem da endocitose rápida é que ela possibilita a sustentação de altas taxas de exocitose repetidas.

Um mecanismo eficiente que acopla a endo e a exocitose pode ser o emprego das mesmas proteínas em dois passos consecutivos e utilizar Ca2+ como um regulador de ambos os processos. O primeiro passo na endocitose é o recrutamento da clatrina para formação das depressões revestidas(coated pits). O AP2 (adaptor protein 2) é uma proteína solúvel complexa que é central na formação das depressões, reunindo a clatrina na membrana. Primeiro a AP2 é ligada na membrana na posição da futura depressão, onde a clatrina é ligada. A proteína com alta afinidade e capacidade de ligação a AP2 é a sinaptotagmina, que também é requisitada para a exocitose disparada por Ca2+, o que sugere que a mesma proteína pode disparar tanto a exocitose quando a endocitose. A ligação da sinaptotagmina a AP2 deve ser regulada. Normalmente, a sinaptotagmina não se liga a AP2 porque todas as membranas contendo esta proteína poderiam ser revestidas pela clatrina, portanto, a ligação da AP2 a sinaptotagmina deve ser ativada em conjunto com a exocitose.

2) Dinamina

Ela pode ser responsável pela rápida endocitose da vesícula sináptica. Esta proteína é uma GTPase que se liga a componentes da maquinaria de endocitose e a fosfolipides. A endocitose é inibida em um mutante de Drosophila sensível a temparatura, chamado Shibire, que bloqueia o brotamento de vesículas revestidas interferindo com a formação de depressões revestidas(coated pits). A dinamina é fosforilada no terminal nervoso pela proteína cinase C e rapidamente defosforilada pela calcinerina sob o influxo de Ca2+. Assim a atividade GTPase da dinamina é regulada por fosforilação e provavelmente está envolvida diretamente na endocitose.

3)Sinaptojanina

É uma proteína que hidrolisa fosfatil inositol fosfato (IP3) e este pode estar envolvido no tráfego de membranas, incluindo o ciclo das vesículas sinápticas. A ação de uma fosfatase na endocitose seria ajustada para terminar o sinal do fosfatil inositol. Isto forneceria um mecanismo para inativação da maquinaria de fusão (exocitose) e ativando o processo de endocitose. Em suporte a essa hipotese, sinaptojanina, da mesma maneira que a dinamina, é defosforilada durante a estimulação do terminal nervoso, sugerindo que estas proteínas sejam coordenadamente reguladas.

IMPLICAÇÕES PARA O TRÁFEGO INTRACELULAR

A liberação do neurotransmissor é baseada em uma via especializada de tráfego intracelular, o ciclo da vesícula sináptica. O processo que inicia a transmissão sináptica, a liberação do neurotransmissor é de central importância para função do cérebro. O ciclo da vesícula difere de muitas outras vias de tráfico intracelular.

A maior diferença está no alto grau de regulação do tráfego intracelular no terminal nervoso: o alvo exclusivo da exocitose na zona ativa, a alta velocidade com que o Ca2+ pode ser liberado, alta regulação coordenada de todos os passos do ciclo e restrição da exocitose da vesícula sináptica no terminal nervoso.

Fonte: www.wyzant.com/www.hurnp.uel.br/www.icb.ufmg.br