Coloração de Gram

Coloração de Gram – O que é

A coloração de Gram é um teste que verifica se há bactérias no local de uma infecção suspeita ou em certos fluidos corporais, como sangue ou urina. Esses locais incluem garganta, pulmões, órgãos genitais e feridas na pele.

A coloração de Gram é usada para classificar as bactérias em relação à forma, tamanho, morfologia celular e propriedade tintorial.

A coloração de Gram foi originalmente descrita por Christian Gram em 1884 e modificada por Hucker em 1921, comumente usada na prática bacteriológica devido proporcionar uma melhor estabilidade dos reagentes e melhor diferenciação dos microrganismos.

A coloração de Gram é uma técnica comum usada para diferenciar dois grandes grupos de bactérias com base em seus diferentes constituintes da parede celular.

O procedimento de coloração de Gram distingue entre grupos Gram positivos e Gram negativos colorindo essas células de vermelho ou violeta. As bactérias Gram positivas coram com o violeta devido à presença de uma espessa camada de peptidoglicano em suas paredes celulares, que retém o cristal violeta com o qual essas células são coradas. Alternativamente, as bactérias Gram negativas coram de vermelho, o que é atribuído a uma parede de peptidoglicano mais fina, que não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração.

As categorias são diagnosticadas com base em como a bactéria reage à coloração de Gram. A coloração de Gram é roxa. Quando a mancha se combina com as bactérias em uma amostra, as bactérias permanecem roxas ou rosa ou vermelhas. Se as bactérias permanecerem roxas, elas são Gram-positivas. Se a bactéria ficar rosa ou vermelha, elas são Gram-negativas.

As duas categorias causam diferentes tipos de infecções:

As infecções Gram-positivas incluem Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), infecções estreptocócicas e choque tóxico.
As infecções Gram-negativas incluem salmonela, pneumonia, infecções do trato urinário e gonorreia.

A coloração de Gram também pode ser usada para diagnosticar infecções fúngicas.

As características de coloração de Gram das bactérias são indicadas como positivas ou negativas, dependendo se a bactéria absorve e retém a coloração violeta de cristal ou não.

O método de Gram se baseia no fato de que quando certas bactérias são coradas pelo o cristal violeta (corante azul) e depois tratadas pela solução de iodoiodetada (lugol), forma-se um composto de coloração escura entre o iodo e o corante, que é fortemente retido por um grupo de bactérias e não pode ser removido pelo descoramento subsequente com o állcool gram positiva.

Outras bactérias, denominadas gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo álcool.

Então, as bactérias gram negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que as gram positivas aparecerão coradas em roxo.

O mecanismo da coloração de Gram está baseado na diferença de permeabilidade da parede celular.

As bactérias gram negativas apresentam uma elevada concentração de lipídeos e uma delgada parede celular quando comparadas com as bactérias gram positivas.

Sugere-se que quando há o tratamento com álcool, os lipídeos das bactérias gram negativas são retirados da parede celular, aumentando a permeabilidade da mesma e fazendo com que estas bactérias percam o primeiro corante (cristal violeta).

As bactérias gram positivas, por possuírem uma menor concentração de lipídeos, se tornam desidratadas com o tratamento pelo álcool, diminuindo a permeabilidade da parede celular e retendo o primeiro corante.

As bactérias Gram-positivas retêm a cor da coloração violeta de cristal na coloração de Gram. Isso é característico de bactérias que têm uma parede celular composta por uma camada espessa de uma determinada substância (especificamente, peptidologlicano contendo ácido teicóico e lipoteicóico complexado ao peptidoglicano).

As bactérias Gram-positivas incluem estafilococos (“estafilococos”), estreptococos (“estreptococos”), pneumococos e a bactéria responsável pela difteria (Cornynebacterium diphtheriae) e antraz (Bacillus anthracis).

As bactérias Gram-negativas perdem a mancha violeta cristal (e assumem a cor da contracoloração vermelha) no método de coloração de Gram. Isso é característico de bactérias que têm uma parede celular composta por uma camada fina de uma substância específica (especificamente, peptidoglicano coberto por uma membrana externa de lipoproteína e lipopolissacarídeo contendo endotoxina).

As bactérias Gram-negativas incluem a maioria das bactérias normalmente encontradas no trato gastrointestinal que podem ser responsáveis pela doença, bem como gonococos (doença venérea) e meningococos (meningite bacteriana). Os organismos responsáveis pela cólera e peste bubônica são Gram-negativos.

Coloração de Gram – Uso

A coloração de Gram é usada para determinar se as bactérias estão presentes em uma área do corpo que é normalmente estéril, como o fluido espinhal.

Uma amostra da área infectada é espalhada em uma lâmina de vidro e deixada secar.

É aplicada uma série de manchas e um descolorante.

A lâmina corada é então examinada sob um microscópio, onde as bactérias aparecem roxas (gram positivas) ou rosa (gram negativas).

O nome do teste é em homenagem ao Dr. Christian Gram, que inventou o processo.

Hans Christian Joachim Gram (1853 – 1838)

A coloração de Gram pode prever o tipo de bactéria que causa uma infecção, como pneumonia pneumocócica ou abscesso estafilocócico. Os vírus não podem ser vistos com a coloração de Gram, pois não possuem a parede celular, que retém a coloração.

Como a amostra é coletada para teste?

Normalmente, as amostras são coletadas com esfregaços estéreis para obter células ou exsudato no local da infecção suspeita. Os fluidos corporais podem ser coletados em recipientes estéreis ou por agulha e seringa.

Como isso é usado?

A coloração de Gram e a cultura do material de um local infectado são os testes microbiológicos mais comumente realizados para identificar a causa de uma infecção.

Frequentemente, determinar se uma infecção é causada por um organismo que é Gram positivo ou Gram negativo será suficiente para permitir que um médico prescreva o tratamento com um antibiótico apropriado enquanto aguarda a conclusão de testes mais específicos.

A ausência ou presença de glóbulos brancos na coloração de Gram pode determinar a adequação da amostra.

Como funciona a coloração de Gram?

Etapas de coloração de Gram

A coloração de Gram envolve três processos: coloração com um corante solúvel em água denominado violeta cristal, descoloração e contra coloração, geralmente com safanina.

Devido às diferenças na espessura de uma camada de peptidoglicano na membrana celular entre bactérias Gram positivas e Gram negativas, as bactérias Gram positivas (com uma camada de peptidoglicano mais espessa) retêm a coloração violeta de cristal durante o processo de descoloração, enquanto as bactérias Gram negativas perdem a coloração violeta de cristal e, em vez disso, são corados pela safranina no processo de coloração final.

O processo envolve três etapas:

1) As células são coradas com corante violeta cristal. Em seguida, uma solução de iodo de Gram (iodo e iodeto de potássio) é adicionada para formar um complexo entre o cristal violeta e o iodo. Este complexo é uma molécula maior do que a mancha violeta de cristal original e o iodo e é insolúvel em água.
2) Um descolorante, como álcool etílico ou acetona, é adicionado à amostra, o que desidrata a camada de peptidoglicano, encolhendo e tensionando-a. O grande complexo de cristal violeta-iodo não é capaz de penetrar nesta camada apertada de peptidoglicano e, portanto, fica preso na célula em bactérias Gram positivas. Por outro lado, a membrana externa das bactérias Gram negativas é degradada e a camada mais fina de peptidoglicano das células Gram negativas é incapaz de reter o complexo cristal violeta-iodo e a cor é perdida.
3) Uma contracoloração, como a safranina fracamente solúvel em água, é adicionada à amostra, manchando-a de vermelho. Uma vez que a safranina é mais clara do que o violeta cristal, ela não interrompe a coloração roxa nas células Gram positivas. No entanto, as células Gram negativas descoloridas são coradas de vermelho.

Técnica da Coloração de Gram

Fazer um esfregaço do material desejado em uma lâmina
Fixar o material, com o fogo, na lâmina
Cobrir o esfregaço com cristal violeta (1º corante) por 1 minuto
Escorrer o corante. Cobrir com lugol (mordente) por 1 minuto
Lavar em água corrente de baixa pressão
Descorar com álcool-cetona por 1 ? 5 segundos
Lavar em água corrente de baixa pressão
Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl-Neelsen 1:10 (2º corante) por 30 segundos
Lavar em água corrente de baixa pressão
Deixar secar espontaneamente
Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

Fonte: labtestsonline.org.br/www.geocities.com/serc.carleton.edu/medlineplus.gov